分子診斷技術(shù)是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢測(cè)中不可或缺的一部分,特別是在病原體檢測(cè)、遺傳病篩查以及癌癥早期診斷等方面,核酸擴(kuò)增技術(shù)發(fā)揮了關(guān)鍵作用。PCR是目前最廣泛使用的分子診斷技術(shù),但由于其依賴(lài)于復(fù)雜的溫控設(shè)備和反應(yīng)周期較長(zhǎng),限制了其在一些領(lǐng)域的應(yīng)用。因此,等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(如LAMP、NASBA等)逐漸成為替代方案,尤其在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和快速診斷中表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。
在過(guò)去的5年里,LAMP反應(yīng)是等溫?cái)U(kuò)增中關(guān)注度最高,發(fā)展最快的一種技術(shù),它已被用于快速診斷流感、結(jié)核病、寨卡病毒等。不過(guò)LAMP檢測(cè)的開(kāi)發(fā)存在一定難度,尤其是在引物設(shè)計(jì)和多重檢測(cè)上,給許多研發(fā)人員帶來(lái)了不小的挑戰(zhàn),那么有沒(méi)有更簡(jiǎn)單、更容易開(kāi)發(fā)的等溫?cái)U(kuò)增呢?其實(shí)在LAMP技術(shù)出現(xiàn)之前,就已經(jīng)有了,這就是本文重點(diǎn)要介紹的NASBA技術(shù)。
NASBA(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification,核酸序列基礎(chǔ)擴(kuò)增)技術(shù)作為一種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù),不依賴(lài)于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)中所需的溫度循環(huán),而是在恒定的溫度下通過(guò)一系列的酶反應(yīng)進(jìn)行核酸擴(kuò)增。該技術(shù)的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)是能夠在不依賴(lài)高溫的情況下,進(jìn)行高效的核酸擴(kuò)增,尤其適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。
NASBA核心原理
NASBA技術(shù)是以RNA模板進(jìn)行等溫核酸擴(kuò)增技術(shù),先以單鏈RNA為模板,在42℃恒溫條件下,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase H和T7 RNA聚合酶以及正向引物和反向引物來(lái)模擬體內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄病的的復(fù)制機(jī)制進(jìn)行目標(biāo)RNA的擴(kuò)增。90分鐘可以獲得10-12 倍產(chǎn)物,靈敏度最高達(dá)單個(gè)拷貝;相對(duì)于免疫學(xué)方法或其他核酸檢測(cè)方法,NASBA技術(shù)特異性強(qiáng)、檢測(cè)快速,由于反應(yīng)產(chǎn)物是單鏈RNA,因而可采用雜交檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)提高該技術(shù)的敏感性和特異性。
反應(yīng)組分:
模板RNA
引物對(duì):兩種特異性引物:
第一引物(P1):在5’端攜帶T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子序列。
第二引物(P2):互補(bǔ)于目標(biāo)RNA的下游序列。
三種酶:
AMV逆轉(zhuǎn)錄酶:用于合成cDNA
RNase H:降解RNA:DNA雜交鏈中的RNA
T7 RNA聚合酶:從雙鏈DNA模板中轉(zhuǎn)錄生成RNA擴(kuò)增產(chǎn)物
核苷酸(dNTPs 和 NTPs)
緩沖液:優(yōu)化酶活性
反應(yīng)步驟-NASBA反應(yīng)分為以下幾個(gè)階段:
1. 初始變性:63-65℃進(jìn)行20分鐘,對(duì)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行解旋
2. 逆轉(zhuǎn)錄
目標(biāo)RNA和引物結(jié)合:模板RNA與含有T7啟動(dòng)子序列的第一引物P1結(jié)合
合成第一鏈cDNA:AMV利用RNA模板,從P1引物開(kāi)始,合成與RNA互補(bǔ)的單鏈cDNA
3. RNA降解
RNase H作用:RNase H特異性降解RNA:DNA雜交分子中的RNA鏈,留下單鏈cDNA
4. 第二鏈cDNA合成
第二引物P2結(jié)合:P2引物結(jié)合到單鏈cDNA的互補(bǔ)區(qū)域
延伸:AMV逆轉(zhuǎn)錄酶從P2引物開(kāi)始合成第二條DNA鏈,形成雙鏈DNA
5. RNA擴(kuò)增
T7 RNA聚合酶起作用:T7 RNA聚合酶識(shí)別雙鏈DNA模板中的T7啟動(dòng)子序列,并以此為模板轉(zhuǎn)錄生成大量RNA分子
循環(huán)擴(kuò)增:新生成的RNA分子可作為模板,重新進(jìn)入上述循環(huán),進(jìn)一步擴(kuò)增產(chǎn)物,從2-5開(kāi)始進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán),在41°C下進(jìn)行。
NASBA反應(yīng)具體過(guò)程
反應(yīng)特點(diǎn):
直接對(duì)RNA進(jìn)行擴(kuò)增
等溫:反應(yīng)在恒定溫度(通常為41°C)下進(jìn)行,無(wú)需熱循環(huán)設(shè)備。
*雖然NASBA有初始變性的步驟,但是由于不需要像PCR一樣在高低溫中循環(huán),所以仍然被認(rèn)為是一種等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。
高特異性:T7 RNA聚合酶特異性識(shí)別T7啟動(dòng)子,并且雙引物設(shè)計(jì)確保擴(kuò)增的特異性
線性RNA產(chǎn)物:與PCR生成的指數(shù)擴(kuò)增不同,NASBA生成線性擴(kuò)增的RNA產(chǎn)物。
NASBA產(chǎn)物檢測(cè)
雖然NASBA擴(kuò)增產(chǎn)物為RNA,與LAMP的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物不同,但是NASBA產(chǎn)物檢測(cè)方法與LAMP幾乎一致,具體包括:
1. 熒光探針?lè)ǎ?/strong>熒光探針(如Taqman探針)在擴(kuò)增過(guò)程中與目標(biāo)RNA序列結(jié)合,只有在探針與目標(biāo)RNA序列結(jié)合并被T7 RNA聚合酶降解時(shí),熒光信號(hào)才會(huì)被釋放出來(lái),實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)產(chǎn)物的增加。
2. 凝膠電泳法:將擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳分離,利用不同分子大小的差異來(lái)判斷是否成功擴(kuò)增了目標(biāo)序列。凝膠電泳可使用DNA/RNA染料(如EB染料或SYBR Green)進(jìn)行可視化。
3. 比色法:利用與擴(kuò)增產(chǎn)物反應(yīng)的顏色變化來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。例如,使用帶有酶標(biāo)簽的探針或染料,當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)完成后,加入底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)。顏色的變化代表RNA的存在和數(shù)量,適用于POC平
4. 熒光染料法:嵌合型的熒光染料(如SYBR Green)能與雙鏈RNA結(jié)合,并在激發(fā)后發(fā)出熒光信號(hào)。通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度變化,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的定量分析。
5. 電化學(xué)法:通過(guò)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)電化學(xué)信號(hào)的影響來(lái)實(shí)現(xiàn)定量分析。電化學(xué)傳感器能夠感應(yīng)到反應(yīng)過(guò)程中的離子變化、電流或電位變化,從而推測(cè)出目標(biāo)RNA的濃度。
6.側(cè)向?qū)游龇ǎ?/span>通過(guò)膠體金或熒光法捕捉RNA產(chǎn)物在試紙條上顯色
不同的檢測(cè)技術(shù)各有優(yōu)勢(shì),選擇合適的檢測(cè)方法取決于實(shí)驗(yàn)的需求。例如,熒光探針檢測(cè)常用于高靈敏度的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),凝膠電泳適用于基礎(chǔ)研究階段的產(chǎn)物驗(yàn)證,比色法和熒光染料染色則多用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。通過(guò)結(jié)合這些技術(shù),NASBA擴(kuò)增可以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)、高效的分子診斷,廣泛應(yīng)用于病原體檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)以及生物標(biāo)志物分析等領(lǐng)域。
NASBA發(fā)展史
NASBA在分子生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用歷史源遠(yuǎn)流長(zhǎng),甚至早于LAMP。
1. 起源:
1991年,由荷蘭埃因霍溫技術(shù)大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)(由Willem A. J. H. van der Velden等人)提出并成功開(kāi)發(fā),從此RNA擴(kuò)增檢測(cè)不再依賴(lài)于傳統(tǒng)PCR。
2. 發(fā)展歷程:從基礎(chǔ)研究到廣泛應(yīng)用
在最初的幾年里,NASBA主要被用于實(shí)驗(yàn)室的研究,特別是在基因表達(dá)分析和病毒載量監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域,如HIV和HBV等。1992年,科學(xué)家們進(jìn)一步優(yōu)化了NASBA技術(shù),確保其在不同的實(shí)驗(yàn)條件下穩(wěn)定工作,特別是在使用樣本來(lái)源廣泛的情況下(如血液、尿液、唾液等)。NASBA逐漸成為一個(gè)重要的研究工具,并且通過(guò)不斷優(yōu)化其酶體系和反應(yīng)條件,變得更加高效和適應(yīng)性強(qiáng)。
3. 技術(shù)進(jìn)步:與其他核酸擴(kuò)增技術(shù)的結(jié)合
隨著分子診斷技術(shù)的快速發(fā)展,NASBA技術(shù)也在不斷創(chuàng)新和改進(jìn)。與傳統(tǒng)的PCR相比,NASBA的一個(gè)重要優(yōu)勢(shì)是無(wú)需溫控設(shè)備即可進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增,并且比LAMP反應(yīng)更低能耗,這使得其在資源有限的環(huán)境下,尤其是在POCT和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中的應(yīng)用得到了快速推廣。
在21世紀(jì)初,NASBA開(kāi)始與微流控技術(shù)相結(jié)合,形成更具創(chuàng)新性的診斷平臺(tái)。這些集成系統(tǒng)通過(guò)將NASBA擴(kuò)增技術(shù)與自動(dòng)化的微流控芯片、傳感器技術(shù)結(jié)合,使得檢測(cè)變得更加靈敏、便捷,并且能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過(guò)程。與傳統(tǒng)PCR設(shè)備相比,這種小型化設(shè)備不僅降低了成本,還提高了檢測(cè)的便捷性和可操作性。
4. 市場(chǎng)應(yīng)用:從科研到臨床
隨著技術(shù)的不斷成熟,NASBA開(kāi)始進(jìn)入更廣泛的市場(chǎng)應(yīng)用。在20世紀(jì)90年代末和21世紀(jì)初,許多生物技術(shù)公司將NASBA技術(shù)商業(yè)化,并將其應(yīng)用于臨床檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全等領(lǐng)域。特別是在病毒檢測(cè)和微生物檢測(cè)方面,NASBA已經(jīng)成為一個(gè)不可或缺的技術(shù)工具。
例如,在HIV、HCV、流感等病毒感染的早期檢測(cè)中,NASBA能夠提供比PCR更加敏感的檢測(cè)結(jié)果,且具有較短的反應(yīng)時(shí)間。這使得它在流行病防控、早期診斷以及治療監(jiān)測(cè)中得到了廣泛應(yīng)用。
此外,NASBA技術(shù)還被應(yīng)用于食品安全檢測(cè)、水質(zhì)監(jiān)控和環(huán)境污染監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域,成為了一個(gè)多用途的核酸擴(kuò)增技術(shù)。
5. 當(dāng)前與未來(lái)發(fā)展:多領(lǐng)域應(yīng)用與進(jìn)一步創(chuàng)新
進(jìn)入21世紀(jì)20年代后,NASBA技術(shù)仍在持續(xù)創(chuàng)新和完善。隨著分子生物學(xué)、納米技術(shù)、微流控技術(shù)和智能設(shè)備的快速發(fā)展,NASBA不僅僅局限于傳統(tǒng)的分子診斷領(lǐng)域,還與這些新興技術(shù)相結(jié)合,進(jìn)一步拓寬了其應(yīng)用場(chǎng)景。例如,結(jié)合納米傳感器技術(shù),NASBA可以在快速檢測(cè)中直接提供定量結(jié)果,而不再僅僅是定性檢測(cè)。
此外,隨著基因組學(xué)和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展,NASBA也被用來(lái)幫助實(shí)現(xiàn)個(gè)性化醫(yī)療。通過(guò)檢測(cè)特定的基因突變或病原體,NASBA能夠提供精確的病理信息,協(xié)助醫(yī)生為患者定制個(gè)性化治療方案。
NASBA技術(shù)優(yōu)勢(shì)
1. 高靈敏度與高特異性:NASBA能有效檢測(cè)低至拷貝級(jí)別的目標(biāo)核酸,因此在病原微生物檢測(cè)、病毒檢測(cè)等方面具有廣泛應(yīng)用。
2. 等溫操作:與PCR相比,NASBA無(wú)需復(fù)雜的溫控設(shè)備,只需要在常溫下即可完成反應(yīng)。與LAMP檢測(cè)相比,反應(yīng)溫度更低,對(duì)能耗和設(shè)備要求更低,這使得其在便捷性上占有獨(dú)特優(yōu)勢(shì),特別適合于現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)。
3. 快速擴(kuò)增:由于其不依賴(lài)于溫度循環(huán),NASBA擴(kuò)增反應(yīng)相較于傳統(tǒng)PCR技術(shù)更加迅速,通??稍?0分鐘內(nèi)完成核酸檢測(cè)。
4. 適應(yīng)性強(qiáng):NASBA可以適應(yīng)多種不同類(lèi)型的樣本,對(duì)樣本中抑制物的耐受性能更強(qiáng),因此在多種臨床和環(huán)境檢測(cè)中都能發(fā)揮作用。
NASBA應(yīng)用
NASBA技術(shù)在分子診斷中的應(yīng)用包括:
1. 病原體的快速檢測(cè):例如HIV、流感、HBV、HCV以及新冠病毒等病毒的核酸檢測(cè),NASBA技術(shù)能夠在短時(shí)間內(nèi)提供準(zhǔn)確的結(jié)果,尤其適用于快速篩查和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
2. 環(huán)境監(jiān)測(cè):例如在水源監(jiān)測(cè)中,NASBA可用于檢測(cè)水體中的致病微生物,通過(guò)對(duì)環(huán)境樣本進(jìn)行快速、靈敏的檢測(cè),有效保障公眾健康。
3. 現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)與POCT:NASBA對(duì)設(shè)備的要求比LAMP反應(yīng)溫度更低,因此更適合在資源有限的地區(qū)或急診情況下,NASBA可以為醫(yī)生提供即時(shí)的診斷結(jié)果,幫助做出快速?zèng)Q策。
4. 個(gè)性化醫(yī)療與精準(zhǔn)醫(yī)療:隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展,NASBA在個(gè)體化醫(yī)療中的作用也逐漸凸顯。通過(guò)檢測(cè)特定的遺傳標(biāo)志物或病原體,NASBA技術(shù)能夠幫助醫(yī)生為患者提供量身定制的治療方案。
NASBA未來(lái)展望
隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和優(yōu)化,NASBA有望在更多領(lǐng)域發(fā)揮作用。其在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、快速診斷以及個(gè)性化治療中的潛力將進(jìn)一步推動(dòng)分子診斷技術(shù)的發(fā)展。此外,結(jié)合其他創(chuàng)新技術(shù)如微流控芯片、智能手機(jī)平臺(tái)等,NASBA的應(yīng)用場(chǎng)景將變得更加廣泛,為疾病的早期發(fā)現(xiàn)和治療提供更多可能性。
在中國(guó),PCR技術(shù)發(fā)展已經(jīng)非常成熟,標(biāo)準(zhǔn)化程度高,并且有完整的供應(yīng)鏈和監(jiān)管體系,作為IVD市場(chǎng)的主導(dǎo)技術(shù)在相當(dāng)程度上限制了NASBA技術(shù)的普及。其實(shí)NASBA技術(shù)在國(guó)際上已有較長(zhǎng)的歷史,但在中國(guó)市場(chǎng)許多IVD企業(yè)和實(shí)驗(yàn)室對(duì)NASBA技術(shù)的了解有限,導(dǎo)致整個(gè)市場(chǎng)對(duì)其認(rèn)知度受限,導(dǎo)致NASBA的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)尚未被充分挖掘。
盡管NASBA技術(shù)在中國(guó)IVD市場(chǎng)的推廣面臨多重挑戰(zhàn),隨著對(duì)快速RNA擴(kuò)增需求的增加以及NASBA技術(shù)與新興技術(shù)(如CRISPR)的結(jié)合,這一技術(shù)在未來(lái)仍可能有其獨(dú)特的發(fā)展空間,特別是在特定病原體檢測(cè)或資源有限的場(chǎng)景中。
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