分子診斷技術(shù)是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢測(cè)中不可或缺的一部分，特別是在病原體檢測(cè)、遺傳病篩查以及癌癥早期診斷等方面，核酸擴(kuò)增技術(shù)發(fā)揮了關(guān)鍵作用。PCR是目前最廣泛使用的分子診斷技術(shù)，但由于其依賴(lài)于復(fù)雜的溫控設(shè)備和反應(yīng)周期較長(zhǎng)，限制了其在一些領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（如LAMP、NASBA等）逐漸成為替代方案，尤其在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和快速診斷中表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

在過(guò)去的5年里，LAMP反應(yīng)是等溫?cái)U(kuò)增中關(guān)注度最高，發(fā)展最快的一種技術(shù)，它已被用于快速診斷流感、結(jié)核病、寨卡病毒等。不過(guò)LAMP檢測(cè)的開(kāi)發(fā)存在一定難度，尤其是在引物設(shè)計(jì)和多重檢測(cè)上，給許多研發(fā)人員帶來(lái)了不小的挑戰(zhàn)，那么有沒(méi)有更簡(jiǎn)單、更容易開(kāi)發(fā)的等溫?cái)U(kuò)增呢？其實(shí)在LAMP技術(shù)出現(xiàn)之前，就已經(jīng)有了，這就是本文重點(diǎn)要介紹的NASBA技術(shù)。

NASBA（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification，核酸序列基礎(chǔ)擴(kuò)增）技術(shù)作為一種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，不依賴(lài)于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)中所需的溫度循環(huán)，而是在恒定的溫度下通過(guò)一系列的酶反應(yīng)進(jìn)行核酸擴(kuò)增。該技術(shù)的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)是能夠在不依賴(lài)高溫的情況下，進(jìn)行高效的核酸擴(kuò)增，尤其適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

NASBA核心原理

NASBA技術(shù)是以RNA模板進(jìn)行等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，先以單鏈RNA為模板，在42℃恒溫條件下，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase H和T7 RNA聚合酶以及正向引物和反向引物來(lái)模擬體內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄病的的復(fù)制機(jī)制進(jìn)行目標(biāo)RNA的擴(kuò)增。90分鐘可以獲得10-12 倍產(chǎn)物，靈敏度最高達(dá)單個(gè)拷貝；相對(duì)于免疫學(xué)方法或其他核酸檢測(cè)方法，NASBA技術(shù)特異性強(qiáng)、檢測(cè)快速，由于反應(yīng)產(chǎn)物是單鏈RNA，因而可采用雜交檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)提高該技術(shù)的敏感性和特異性。

反應(yīng)組分：

• 模板RNA

• 引物對(duì)：兩種特異性引物：

第一引物（P1）：在5’端攜帶T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子序列。

第二引物（P2）：互補(bǔ)于目標(biāo)RNA的下游序列。

• 三種酶：

AMV逆轉(zhuǎn)錄酶:用于合成cDNA

RNase H：降解RNA:DNA雜交鏈中的RNA

T7 RNA聚合酶：從雙鏈DNA模板中轉(zhuǎn)錄生成RNA擴(kuò)增產(chǎn)物

• 核苷酸（dNTPs 和 NTPs）

• 緩沖液：優(yōu)化酶活性

反應(yīng)步驟-NASBA反應(yīng)分為以下幾個(gè)階段：

1. 初始變性：63-65℃進(jìn)行20分鐘，對(duì)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行解旋

2. 逆轉(zhuǎn)錄

• 目標(biāo)RNA和引物結(jié)合：模板RNA與含有T7啟動(dòng)子序列的第一引物P1結(jié)合

• 合成第一鏈cDNA：AMV利用RNA模板，從P1引物開(kāi)始，合成與RNA互補(bǔ)的單鏈cDNA

3. RNA降解

RNase H作用：RNase H特異性降解RNA:DNA雜交分子中的RNA鏈，留下單鏈cDNA

4. 第二鏈cDNA合成

• 第二引物P2結(jié)合：P2引物結(jié)合到單鏈cDNA的互補(bǔ)區(qū)域

• 延伸：AMV逆轉(zhuǎn)錄酶從P2引物開(kāi)始合成第二條DNA鏈，形成雙鏈DNA

5. RNA擴(kuò)增

• T7 RNA聚合酶起作用：T7 RNA聚合酶識(shí)別雙鏈DNA模板中的T7啟動(dòng)子序列，并以此為模板轉(zhuǎn)錄生成大量RNA分子

• 循環(huán)擴(kuò)增：新生成的RNA分子可作為模板，重新進(jìn)入上述循環(huán)，進(jìn)一步擴(kuò)增產(chǎn)物，從2-5開(kāi)始進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)，在41°C下進(jìn)行。

NASBA反應(yīng)具體過(guò)程

反應(yīng)特點(diǎn)：

• 直接對(duì)RNA進(jìn)行擴(kuò)增
  

• 等溫：反應(yīng)在恒定溫度（通常為41°C）下進(jìn)行，無(wú)需熱循環(huán)設(shè)備。

  *雖然NASBA有初始變性的步驟，但是由于不需要像PCR一樣在高低溫中循環(huán)，所以仍然被認(rèn)為是一種等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。 

• 高特異性：T7 RNA聚合酶特異性識(shí)別T7啟動(dòng)子，并且雙引物設(shè)計(jì)確保擴(kuò)增的特異性

• 線性RNA產(chǎn)物：與PCR生成的指數(shù)擴(kuò)增不同，NASBA生成線性擴(kuò)增的RNA產(chǎn)物。

NASBA產(chǎn)物檢測(cè)

NASBA發(fā)展史

隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和優(yōu)化，NASBA有望在更多領(lǐng)域發(fā)揮作用。其在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、快速診斷以及個(gè)性化治療中的潛力將進(jìn)一步推動(dòng)分子診斷技術(shù)的發(fā)展。此外，結(jié)合其他創(chuàng)新技術(shù)如微流控芯片、智能手機(jī)平臺(tái)等，NASBA的應(yīng)用場(chǎng)景將變得更加廣泛，為疾病的早期發(fā)現(xiàn)和治療提供更多可能性。

在中國(guó)，PCR技術(shù)發(fā)展已經(jīng)非常成熟，標(biāo)準(zhǔn)化程度高，并且有完整的供應(yīng)鏈和監(jiān)管體系，作為IVD市場(chǎng)的主導(dǎo)技術(shù)在相當(dāng)程度上限制了NASBA技術(shù)的普及。其實(shí)NASBA技術(shù)在國(guó)際上已有較長(zhǎng)的歷史，但在中國(guó)市場(chǎng)許多IVD企業(yè)和實(shí)驗(yàn)室對(duì)NASBA技術(shù)的了解有限，導(dǎo)致整個(gè)市場(chǎng)對(duì)其認(rèn)知度受限,導(dǎo)致NASBA的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)尚未被充分挖掘。

盡管NASBA技術(shù)在中國(guó)IVD市場(chǎng)的推廣面臨多重挑戰(zhàn)，隨著對(duì)快速RNA擴(kuò)增需求的增加以及NASBA技術(shù)與新興技術(shù)（如CRISPR）的結(jié)合，這一技術(shù)在未來(lái)仍可能有其獨(dú)特的發(fā)展空間，特別是在特定病原體檢測(cè)或資源有限的場(chǎng)景中。

本文系轉(zhuǎn)載，文章來(lái)源：邁迪安生物科技