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標(biāo)簽蛋白與重組蛋白間的“剪刀”——HRV 3C蛋白酶

2025-04-07 11:22:09

重組蛋白技術(shù)的原理是利用 DNA 重組技術(shù),將外源蛋白基因連接到合適的表達(dá)載體并通過宿主細(xì)胞的生物機(jī)制使其表達(dá)進(jìn)而得到理想的重組蛋白。重組蛋白表達(dá)通常會通過添加融合標(biāo)簽的方式來提高目的蛋白的溶解性和促進(jìn)目的蛋白的折疊等,根據(jù)實際需求,某些融合標(biāo)簽需要被去除。在獲得目的蛋白前,需要特定的蛋白酶將融合標(biāo)簽切除。常用的蛋白酶有腸激酶、凝血酶、Factor Xa等,它們的酶切最適溫度在25-37℃,此溫度范圍會使得一些目的蛋白被非特異性酶切。


表1.常見的用于切除標(biāo)簽的蛋白酶


人鼻病毒(HRV)是單股正鏈小RNA病毒,其編碼的3C蛋白酶屬于半胱氨酸蛋白酶家族,HRV 3C蛋白酶能特異性地識別七肽序列Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly,并在Gln和Gly氨基酸殘基之間進(jìn)行酶切,主要用于切除融合蛋白的標(biāo)簽,如GST、His等。

寶銳生物的HRV 3C蛋白酶突變體,分子量40kDa,可識別切割LEVLFQ↓G,酶切后,在目的蛋白的N端僅有一個額外的Gly氨基酸殘基,從而最大限度地減少了對目的蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響。寶銳HRV 3C也可以識別切割LEVLFQ↓M位點。

圖1.HRV 3C 蛋白酶識別切割序列


寶銳生物利用基因工程表達(dá)的HRV 3C Protease的最佳酶切溫度是4℃,特異性強(qiáng),酶切后的產(chǎn)物清晰,與主流品牌的產(chǎn)品酶切效果相當(dāng)。



不同酶量下切割100μg底物蛋白效率驗證:

取寶銳生物和N公司HRV 3C Protease按照4U、2U、1U的酶投入量,4℃反應(yīng)過夜后取樣做SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色。反應(yīng)體系如下:


備注:substrate protein為融合蛋白-LEVLFQ↓G-目標(biāo)蛋白,約66kDa,使用HRV 3C Protease 酶切后會獲得約40kDa的融合蛋白和26kDa的目標(biāo)蛋白。


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實驗結(jié)果如下:

寶銳 HRV 3C Protease的表現(xiàn)力與進(jìn)口N公司的產(chǎn)品相當(dāng)。



實驗結(jié)論


寶銳生物 HRV 3C Protease在4℃ 過夜的條件下能夠完成底物蛋白的切割,酶切產(chǎn)物清晰,酶切產(chǎn)物的條帶與進(jìn)口N公司的產(chǎn)品一致,無非特異性切割。




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參考文獻(xiàn):

Mei M , Fan X , Zhou Y ,et al.A combinatorial strategy for HRV 3C protease engineering to achieve the N-terminal free cleavage[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2024, 265.DOI:10.1016/j.ijbiomac.2024.131066.

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Li H J , Wang W J , Shi R .Gene cloning, expression, purification and activity of human rhinovirus 3C protease[J].Chinese Journal of Biologicals, 2007, 20(4):240-243.

Zhejun D , Haijian Z , Xiaomao X ,et al.Expression,purification and cleavage activity analysis of self-processed recombinant MBP-HRV 3C fusion protease in E.coli expression system[J].International Journal of Laboratory Medicine, 2014.

Georgia,Antoniou,Irineos,et al.Optimization of Soluble Expression and Purification of Recombinant Human Rhinovirus Type-14 3C Protease Using Statistically Designed Experiments: Isolation and Characterization of the Enzyme.[J].Molecular Biotechnology, 2017.DOI:10.1007/s12033-017-0032-9.

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