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mRNA技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域主要分為：免疫療法、蛋白質(zhì)替代療法、基因編輯以及再生醫(yī)學(xué)療法，其中免疫療法中的腫瘤免疫和預(yù)防性疫苗是目前的研究熱點(diǎn)，也是技術(shù)最為成熟的領(lǐng)域。
根據(jù)新型冠狀病毒預(yù)防用mRNA疫苗藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）關(guān)于載體的相關(guān)規(guī)定如下：
//模板設(shè)計(jì)、轉(zhuǎn)錄模板質(zhì)粒構(gòu)建和菌種庫(kù)研究資料//
1. 目的抗原選擇依據(jù)及來(lái)源
1.1
明確目的抗原來(lái)源、氨基酸和基因序列及蛋白結(jié)構(gòu)，與當(dāng)前流行株的核苷酸和氨基酸同源性進(jìn)行分析。
1.2
明確目的抗原選擇的依據(jù)以及其表達(dá)蛋白在預(yù)防新型冠狀病毒中的作用或作用機(jī)理。
1.3
提供目的產(chǎn)物的理論序列、分子量、分子式、二硫鍵（如有）、修飾（如有）等重要結(jié)構(gòu)信息。
2. DNA轉(zhuǎn)錄模板序列設(shè)計(jì)及結(jié)構(gòu)
2.1
對(duì)DNA轉(zhuǎn)錄模板設(shè)計(jì)進(jìn)行全面闡述，除目的抗原涉及的mRNA序列外，需重點(diǎn)提供其功能性元件的設(shè)計(jì)及確認(rèn)研究結(jié)果，如，帽子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的選擇，5’UTR和3’UTR的設(shè)計(jì)，信號(hào)肽的設(shè)計(jì)，Poly(A)加尾結(jié)構(gòu)/長(zhǎng)度設(shè)計(jì)、所用核苷三磷酸（NTP）類(lèi)型及其修飾信息等。
2.2
若對(duì)編碼目標(biāo)抗原的mRNA序列進(jìn)行了任何修飾、序列改構(gòu)或序列優(yōu)化（如密碼子優(yōu)化等），均應(yīng)詳細(xì)提供修飾或序列更改的依據(jù)與目的（如提高mRNA翻譯效率、降低先天免疫原性、增加穩(wěn)定性等）。應(yīng)提供結(jié)構(gòu)示意圖等，并對(duì)基因修飾或序列改構(gòu)的利弊進(jìn)行權(quán)衡分析，提供確認(rèn)的支持性研究結(jié)果。如可能，應(yīng)評(píng)估構(gòu)建的mRNA疫苗本身的免疫原性。
2.3
某些情況下，若構(gòu)建的基因序列包括除抗原目的基因以外的其它基因序列時(shí)，應(yīng)對(duì)額外引入基因序列的作用和選擇依據(jù)進(jìn)行分析，如具有利于S蛋白三聚體形成的額外插入序列等，并提供相應(yīng)序列設(shè)計(jì)及確認(rèn)研究數(shù)據(jù)結(jié)果。
1
應(yīng)對(duì)轉(zhuǎn)錄模板的控制元件和選擇標(biāo)記的序列與來(lái)源進(jìn)行闡述，如：轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止序列、抗生素抗性標(biāo)記等進(jìn)行分析?？股厥褂脩?yīng)符合《中國(guó)藥典》的相關(guān)要求。
2
應(yīng)提供構(gòu)建和制備轉(zhuǎn)錄模板質(zhì)粒的詳細(xì)信息和步驟、鑒定及確證方法。
3
對(duì)轉(zhuǎn)錄模板質(zhì)粒應(yīng)結(jié)合工程菌種子庫(kù)的檢定進(jìn)行全基因序列分析及確認(rèn)，提供用于生產(chǎn)mRNA的轉(zhuǎn)錄模板的全長(zhǎng)核苷酸序列，尤其對(duì)轉(zhuǎn)錄模板的控制元件、插入的目的基因序列、選擇標(biāo)記基因有無(wú)變異等進(jìn)行分析。
工程菌應(yīng)按《中華人民共和國(guó)藥典》相關(guān)規(guī)定或與國(guó)際通行要求建立種子庫(kù)系統(tǒng)，并提供國(guó)家藥品檢定機(jī)構(gòu)相應(yīng)檢定報(bào)告。
1
明確宿主菌的來(lái)源、基因型、表型以及目標(biāo)克隆篩選的流程。鼓勵(lì)對(duì)宿主菌開(kāi)展鑒定研究，鑒定項(xiàng)目可包括：鑒別、抗生素敏感性等。
2
工程菌的建立及鑒定：經(jīng)轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化后，將合格的目標(biāo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至適宜的工程菌，經(jīng)克隆篩選后建立種子庫(kù)系統(tǒng)。
3
種子庫(kù)的檢定：應(yīng)保證種子庫(kù)無(wú)外源因子污染及目的基因序列和其他元件的準(zhǔn)確性，包括細(xì)菌形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)物純度、質(zhì)粒限制酶切圖譜、目的基因和其他元件測(cè)序等。鼓勵(lì)對(duì)工程菌活性、質(zhì)粒保有率、鑒別、抗生素抗性等指標(biāo)進(jìn)行檢定。
4
傳代穩(wěn)定性研究：開(kāi)展種子庫(kù)遺傳穩(wěn)定性分析（序列大小、序列準(zhǔn)確性、質(zhì)粒限制酶切圖譜、質(zhì)?？截悢?shù)）并明確各級(jí)種子庫(kù)的限定傳代代次及依據(jù)。說(shuō)明各級(jí)種子庫(kù)的制備規(guī)模、保存條件、擴(kuò)增條件、允許的傳代次數(shù)等信息。
應(yīng)對(duì)模板進(jìn)行鑒別、DNA模板濃度/含量、測(cè)序、純度、線性效率（如適用）、雜質(zhì)殘留、微生物限度、內(nèi)毒素等檢測(cè)。鼓勵(lì)申請(qǐng)人建立DNA轉(zhuǎn)錄模板體外轉(zhuǎn)錄活性的質(zhì)控。轉(zhuǎn)錄模板中的雜質(zhì)殘留可能包括宿主菌DNA、宿主菌RNA、宿主蛋白殘留等。
質(zhì)粒模板制備過(guò)程：需對(duì)轉(zhuǎn)錄模板制備的關(guān)鍵工藝參數(shù)及其控制范圍進(jìn)行確認(rèn)，并建立相應(yīng)的過(guò)程控制檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。
1
質(zhì)粒濃度：酶切前濃度，酶切后濃度。質(zhì)粒線性化酶濃度：不同濃度的酶線性化工藝的差異。
2
孵育時(shí)間：酶切時(shí)間與酶種類(lèi)，酶切時(shí)間與體系，酶切時(shí)間與模板類(lèi)型之間的關(guān)系。
3
4
5
6
如需儲(chǔ)存，應(yīng)明確儲(chǔ)存條件、儲(chǔ)存方式并進(jìn)行相關(guān)支持性研究。建議考慮以下質(zhì)控項(xiàng)目：
鑒別：PCR鑒定、酶切鑒定、測(cè)序；
DNA模板濃度/含量：微量分光光度計(jì)、HPLC；
純度：HPLC；
線性效率（如適用）：HPLC；
雜質(zhì)殘留：包括宿主菌DNA、宿主菌RNA、宿主蛋白殘留等；
微生物限度：中國(guó)藥典微生物限度檢測(cè)辦法及標(biāo)準(zhǔn)；
內(nèi)毒素等檢測(cè)：中國(guó)藥典內(nèi)毒素檢測(cè)辦法及標(biāo)準(zhǔn)。
下表為常用的種子庫(kù)菌株的用途和特點(diǎn)：
1.菌液PCR鑒定
菌液PCR是一種快速、高通量篩選目的片段是否存在的方法，操作簡(jiǎn)單。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳圖判斷陽(yáng)性克隆。
其中PCR鑒定引物設(shè)計(jì)要注意的是：優(yōu)選：T7啟動(dòng)子前-poly(A)尾后；必選：ATG-終止密碼子。
2. 酶切鑒定
將陽(yáng)性克隆的菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進(jìn)行質(zhì)粒雙酶切鑒定。重組載體構(gòu)建成功的質(zhì)粒雙酶切會(huì)出現(xiàn)雙條帶。
3. 測(cè)序鑒定
最后通過(guò)測(cè)序進(jìn)一步鑒定是否有目的基因序列，將測(cè)序結(jié)果和目的序列進(jìn)行序列比對(duì)，若構(gòu)建成功會(huì)有100%的比對(duì)率。但需要注意的是，測(cè)序范圍要至少保證T7啟動(dòng)子之前，poly(A)尾之后。如果出現(xiàn)測(cè)序異常，則判斷缺失-是否發(fā)生在序列內(nèi)部，是否對(duì)密碼子產(chǎn)生影響。突變-突變發(fā)生的位點(diǎn)是否會(huì)影響密碼子的閱讀。
研究表明，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA有三種基本結(jié)構(gòu)：超螺旋(Supercoiled，簡(jiǎn)稱SC)，線性(Linear)和開(kāi)環(huán)(opencircular，簡(jiǎn)稱OC)，這三種顆粒有各種聚合形態(tài)。超螺旋被認(rèn)為是一種能夠最有效地提高轉(zhuǎn)染效率和目的基因表達(dá)的質(zhì)粒形式。在基因治療和mRNA疫苗研究中，對(duì)藥用質(zhì)粒的超螺旋含量有明確要求(FDA:>80%，NMPA:≥90%，SMPA:>85%)。
構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒通過(guò)不斷優(yōu)化可得到超螺旋比例滿足實(shí)驗(yàn)需要的質(zhì)粒，進(jìn)而得到我們要的線性化模板。其對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒電泳圖和HPLC圖如下所示：
對(duì)應(yīng)的超螺旋質(zhì)粒純度：62.75％
對(duì)應(yīng)的超螺旋質(zhì)粒純度：77.06％
對(duì)應(yīng)的超螺旋質(zhì)粒純度：83.82％
對(duì)應(yīng)的超螺旋質(zhì)粒純度：84.33％
對(duì)應(yīng)的超螺旋質(zhì)粒純度：88.05％
對(duì)應(yīng)的超螺旋質(zhì)粒純度：94.55％
對(duì)應(yīng)的超螺旋質(zhì)粒純度：94.31％
寶銳生物積極布局生物制藥領(lǐng)域mRNA疫苗原料酶的開(kāi)發(fā)，依托完善的研發(fā)平臺(tái)和開(kāi)發(fā)經(jīng)驗(yàn)，秉承對(duì)產(chǎn)品一貫精益求精的態(tài)度，成功推出mRNA疫苗生產(chǎn)核心原料酶系列產(chǎn)品，該系列產(chǎn)品包括T7 RNA聚合酶、牛痘病毒加帽酶、二氧甲基轉(zhuǎn)移酶、mRNA加尾酶、無(wú)機(jī)焦磷酸酶、RNA酶抑制劑等，為保障我國(guó)生物制藥上游原料的供應(yīng)做出貢獻(xiàn)。
參考文獻(xiàn)：
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3. FDA. Guidance for Industry-Considerations for Plasmid DNA Vaccines for Infectious Disease Indications. CBER. November 2007.
4. FDA. Guidance for Industry-Liposome Drug Products Chemistry, Manufacturing, and Controls; Human Pharmacokinetics and Bioavailability; and Labeling Documentation. CDER. April 2018.
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