Poly(A)尾，作為mRNA的3'端結(jié)構(gòu)，由多個腺苷酸（A）殘基組成，其長度和分布對于mRNA的功能至關(guān)重要。在眾多科學(xué)研究和實(shí)驗中，這一結(jié)構(gòu)已經(jīng)被廣泛地了解和認(rèn)識。該結(jié)構(gòu)在基因表達(dá)的多個層面發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用。

在體外轉(zhuǎn)錄mRNA時，Poly(A)尾巴可以通過兩種方法添加：一種是在DNA模板中編碼，另一種是在轉(zhuǎn)錄后單獨(dú)酶促添加。PCR方法適合小規(guī)模生產(chǎn)，但成本高且有突變風(fēng)險，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。質(zhì)粒生產(chǎn)成本較低，突變風(fēng)險小，但存在重組問題，尤其對于長Poly(A)序列。

有研究表明：模板編碼的Poly(A)可以產(chǎn)生同質(zhì)產(chǎn)物，但酶促后聚腺苷化的產(chǎn)品組成難以控制。減少RNA生產(chǎn)步驟可降低成本。此外，mRNA的酶聚腺苷化需在堿性條件下進(jìn)行，然而mRNA對堿性水解敏感，從而會降低mRNA質(zhì)量（尤其當(dāng)轉(zhuǎn)錄本>3kb時）。使用線性質(zhì)粒系統(tǒng)如pEVL或pJAZZ可以穩(wěn)定克隆長Poly(A)序列，但存在限制。理想方案是擁有一個穩(wěn)定且翻譯效率高的質(zhì)粒模板編碼的Poly(A)尾部。

對Poly（A）尾的分割是否會對大腸桿菌中高拷貝質(zhì)粒載體的重組產(chǎn)生影響進(jìn)行了研究：為了生成Poly（A）尾的重組RNA轉(zhuǎn)錄本，構(gòu)建將DNA序列克隆至目標(biāo)基因下游的質(zhì)粒載體?？紤]到PABP至少需12個腺苷結(jié)合，但單個PABP與Poly(A)結(jié)合不足以支持翻譯，足夠長的片段如Poly(A)3 × 40_6和Poly(A)2 × 60_6可確保每個片段結(jié)合3個以上PABP拷貝，故設(shè)計了不同Poly（A）及間隔分離器的組成（圖1）。

圖1 ：

A120：120A；

3×40_6：40A+6 nt NsiI酶切位點(diǎn)+40A+6 nt NsiI酶切位點(diǎn)+40A+6 nt NsiI酶切位點(diǎn)；2×60_6：60A+6 nt NsiI酶切位點(diǎn)+60A；

2×60_12：60A+12 nt NsiI酶切位點(diǎn)+60A；

2×60_24：60A+24 nt NsiI酶切位點(diǎn)+60A；

2×60_C：60A + C + 60A；

2×60_G：60A +G + 60A；

2×60_T：60A + T+ 60A；

ACH：63A+6 nt NsiI酶切位點(diǎn)+31 PolyC+17 Hairpin；

1×60_HP1：60A+38 Hairpin；

1×60_HP2：60 A+65 Hairpin.

相比于連續(xù)的Poly（A）,分隔開的Poly（A）能大幅度減少質(zhì)粒重組率。

將不同蛋白編碼區(qū)克隆到含不同Poly(A)序列的pUC57-卡那霉素載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后進(jìn)行篩選。結(jié)果顯示如圖2，Poly(A)120格式的重組率超過50%，將Poly(A)拆分為Poly(A)3 × 40或Poly(A)2 × 60可減少重組，其中Poly(A)2 × 60_6的質(zhì)粒重組率最低。

圖2：量化A120的聚(A)尾重組和聚(A)3 × 40_6和聚(A)2 × 60_6的分段聚(A)尾。

Poly（A）分隔開后，相比于分隔前，翻譯效率并不會發(fā)生明顯的改變。

不同Poly（A）尾對mRNA穩(wěn)定性和表達(dá)會有影響，結(jié)果如圖所示，在不同時間點(diǎn)，分段聚(A)構(gòu)建體中的d2EGFP蛋白水平與對照相當(dāng)。計算mRNA產(chǎn)量發(fā)現(xiàn)，分段聚(A)構(gòu)建體在4-24h的產(chǎn)量更高（圖3）。

類似地，熒光素酶編碼mRNA的實(shí)驗表明，分段聚(A)2 × 60_6結(jié)構(gòu)在修飾獨(dú)立的情況下顯著提高了蛋白質(zhì)水平（圖4-A）。不同修飾、不同Poly（A）格式對mRNA數(shù)量沒有差異，在modification1、2中分段Poly(A)2 × 60_6結(jié)構(gòu)的生產(chǎn)效率更高（圖4-C）。與含ACH（圖1）建構(gòu)體相比，具有Poly（A）尾的結(jié)構(gòu)表達(dá)的熒光素酶量顯著增加，進(jìn)一步證實(shí)了ACH構(gòu)建體翻譯效率的降低。

圖3：A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染后d2EGFP蛋白表達(dá)及不同含聚(A) d2EGFP mRNA的定量測定。

圖4：A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24小時熒光素酶表達(dá)及不同多聚A熒光素酶mRNA定量測定。

與具有細(xì)胞內(nèi)報告蛋白(d2EGFP和熒光素酶)的Poly(A)120相比，重組減少和mRNA產(chǎn)量相當(dāng)/更高，故對具有額外生理靶標(biāo)的Poly(A)2×60_6格式進(jìn)行測試。將優(yōu)化的hEPO序列克隆到puc57-卡那霉素載體上，并使用與上相同修飾組產(chǎn)生mRNA。在人HEK293細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗，并通過ELISA測定蛋白濃度（圖5）。

結(jié)果顯示，在不同劑量、時間點(diǎn)或修飾下，兩種Poly(A)格式之間沒有顯著差異。

圖5：轉(zhuǎn)染Poly(A)120-或Poly(A)2×60-containing EPO mRNA后24小時(A)、48小時(B)和72小時(C)，

通過ELISA檢測HEK293細(xì)胞上清中分泌的人促紅細(xì)胞生成素蛋白水平。

對Poly(A)2×60_6或Poly(A)120的CFTR mRNA構(gòu)建體進(jìn)行研究，將使用未修飾的CFTR mRNA在16HBE14o-細(xì)胞中轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后24和48小時，通過western blot檢測CFTR蛋白，發(fā)現(xiàn)使用分段Poly(A)2×60_6與常規(guī)Poly(A)120相比（圖6），對蛋白產(chǎn)量無負(fù)面影響。    

 圖6：western blot法測定16HBE14o-裂解物中CFTR蛋白的相對定量。

研究特定Poly(A)間隔長度，構(gòu)建了兩種新的熒光素酶結(jié)構(gòu)，分別含有12和24 nt間隔。轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)兩種Poly(A)格式的熒光素酶mRNA表達(dá)降低。修飾特異性效應(yīng)可能由于間隔段區(qū)域影響PABP與Poly(A)結(jié)合。增加間隔長度至6 nt以上，無顯著翻譯或穩(wěn)定性優(yōu)勢。

圖7：A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h熒光素酶表達(dá)及不同多聚(A)熒光素酶mRNA定量測定。

無論是C/T/G中哪種作為間隔子，其翻譯效率接近。

構(gòu)建三種以C、T或G為間隔的Poly(A)序列，并在A549細(xì)胞中比較了它們的luciferase mRNA。結(jié)果顯示，與標(biāo)準(zhǔn)Poly(A)120相比，所有分段Poly(A)構(gòu)建體的熒光素酶表達(dá)均更高（圖8），且除少數(shù)例外，mRNA水平相似（圖9）。單核苷酸間隔的片段Poly(A)可能增強(qiáng)了翻譯效率，并減少了重組率。研究推薦使用帶有6或單核苷酸間隔的分段Poly(A)區(qū)域，因為它對蛋白表達(dá)和mRNA半衰期無負(fù)面影響，同時減少了質(zhì)粒重組。

圖8：A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h熒光素酶表達(dá)及不同多聚(A)熒光素酶mRNA定量測定。

圖9：用單核苷酸間隔物定量分析分段Poly(A)尾重組率。(n)用特定Poly(A)格式測試的熒光素酶克隆總數(shù)。

參考文獻(xiàn)：