今天為大家?guī)韒RNA領(lǐng)域研究中的一篇經(jīng)典文獻(xiàn),本文探討了mRNA藥物開發(fā)中,不同形式的poly(A)尾在mRNA制備和后續(xù)翻譯中的影響,對后續(xù)mRNA疫苗或者藥物的序列設(shè)計產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。
Poly(A)尾,作為mRNA的3'端結(jié)構(gòu),由多個腺苷酸(A)殘基組成,其長度和分布對于mRNA的功能至關(guān)重要。在眾多科學(xué)研究和實(shí)驗中,這一結(jié)構(gòu)已經(jīng)被廣泛地了解和認(rèn)識。該結(jié)構(gòu)在基因表達(dá)的多個層面發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用。
在體外轉(zhuǎn)錄mRNA時,Poly(A)尾巴可以通過兩種方法添加:一種是在DNA模板中編碼,另一種是在轉(zhuǎn)錄后單獨(dú)酶促添加。PCR方法適合小規(guī)模生產(chǎn),但成本高且有突變風(fēng)險,限制了其大規(guī)模應(yīng)用。質(zhì)粒生產(chǎn)成本較低,突變風(fēng)險小,但存在重組問題,尤其對于長Poly(A)序列。
有研究表明:模板編碼的Poly(A)可以產(chǎn)生同質(zhì)產(chǎn)物,但酶促后聚腺苷化的產(chǎn)品組成難以控制。減少RNA生產(chǎn)步驟可降低成本。此外,mRNA的酶聚腺苷化需在堿性條件下進(jìn)行,然而mRNA對堿性水解敏感,從而會降低mRNA質(zhì)量(尤其當(dāng)轉(zhuǎn)錄本>3kb時)。使用線性質(zhì)粒系統(tǒng)如pEVL或pJAZZ可以穩(wěn)定克隆長Poly(A)序列,但存在限制。理想方案是擁有一個穩(wěn)定且翻譯效率高的質(zhì)粒模板編碼的Poly(A)尾部。
對Poly(A)尾的分割是否會對大腸桿菌中高拷貝質(zhì)粒載體的重組產(chǎn)生影響進(jìn)行了研究:為了生成Poly(A)尾的重組RNA轉(zhuǎn)錄本,構(gòu)建將DNA序列克隆至目標(biāo)基因下游的質(zhì)粒載體??紤]到PABP至少需12個腺苷結(jié)合,但單個PABP與Poly(A)結(jié)合不足以支持翻譯,足夠長的片段如Poly(A)3 × 40_6和Poly(A)2 × 60_6可確保每個片段結(jié)合3個以上PABP拷貝,故設(shè)計了不同Poly(A)及間隔分離器的組成(圖1)。
圖1 :
A120:120A;
3×40_6:40A+6 nt NsiI酶切位點(diǎn)+40A+6 nt NsiI酶切位點(diǎn)+40A+6 nt NsiI酶切位點(diǎn);2×60_6:60A+6 nt NsiI酶切位點(diǎn)+60A;
2×60_12:60A+12 nt NsiI酶切位點(diǎn)+60A;
2×60_24:60A+24 nt NsiI酶切位點(diǎn)+60A;
2×60_C:60A + C + 60A;
2×60_G:60A +G + 60A;
2×60_T:60A + T+ 60A;
ACH:63A+6 nt NsiI酶切位點(diǎn)+31 PolyC+17 Hairpin;
1×60_HP1:60A+38 Hairpin;
1×60_HP2:60 A+65 Hairpin.
相比于連續(xù)的Poly(A),分隔開的Poly(A)能大幅度減少質(zhì)粒重組率。
將不同蛋白編碼區(qū)克隆到含不同Poly(A)序列的pUC57-卡那霉素載體中,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后進(jìn)行篩選。結(jié)果顯示如圖2,Poly(A)120格式的重組率超過50%,將Poly(A)拆分為Poly(A)3 × 40或Poly(A)2 × 60可減少重組,其中Poly(A)2 × 60_6的質(zhì)粒重組率最低。
圖2:量化A120的聚(A)尾重組和聚(A)3 × 40_6和聚(A)2 × 60_6的分段聚(A)尾。
Poly(A)分隔開后,相比于分隔前,翻譯效率并不會發(fā)生明顯的改變。
不同Poly(A)尾對mRNA穩(wěn)定性和表達(dá)會有影響,結(jié)果如圖所示,在不同時間點(diǎn),分段聚(A)構(gòu)建體中的d2EGFP蛋白水平與對照相當(dāng)。計算mRNA產(chǎn)量發(fā)現(xiàn),分段聚(A)構(gòu)建體在4-24h的產(chǎn)量更高(圖3)。
類似地,熒光素酶編碼mRNA的實(shí)驗表明,分段聚(A)2 × 60_6結(jié)構(gòu)在修飾獨(dú)立的情況下顯著提高了蛋白質(zhì)水平(圖4-A)。不同修飾、不同Poly(A)格式對mRNA數(shù)量沒有差異,在modification1、2中分段Poly(A)2 × 60_6結(jié)構(gòu)的生產(chǎn)效率更高(圖4-C)。與含ACH(圖1)建構(gòu)體相比,具有Poly(A)尾的結(jié)構(gòu)表達(dá)的熒光素酶量顯著增加,進(jìn)一步證實(shí)了ACH構(gòu)建體翻譯效率的降低。
圖3:A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染后d2EGFP蛋白表達(dá)及不同含聚(A) d2EGFP mRNA的定量測定。
圖4:A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24小時熒光素酶表達(dá)及不同多聚A熒光素酶mRNA定量測定。
與具有細(xì)胞內(nèi)報告蛋白(d2EGFP和熒光素酶)的Poly(A)120相比,重組減少和mRNA產(chǎn)量相當(dāng)/更高,故對具有額外生理靶標(biāo)的Poly(A)2×60_6格式進(jìn)行測試。將優(yōu)化的hEPO序列克隆到puc57-卡那霉素載體上,并使用與上相同修飾組產(chǎn)生mRNA。在人HEK293細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗,并通過ELISA測定蛋白濃度(圖5)。
結(jié)果顯示,在不同劑量、時間點(diǎn)或修飾下,兩種Poly(A)格式之間沒有顯著差異。
圖5:轉(zhuǎn)染Poly(A)120-或Poly(A)2×60-containing EPO mRNA后24小時(A)、48小時(B)和72小時(C),
通過ELISA檢測HEK293細(xì)胞上清中分泌的人促紅細(xì)胞生成素蛋白水平。
對Poly(A)2×60_6或Poly(A)120的CFTR mRNA構(gòu)建體進(jìn)行研究,將使用未修飾的CFTR mRNA在16HBE14o-細(xì)胞中轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后24和48小時,通過western blot檢測CFTR蛋白,發(fā)現(xiàn)使用分段Poly(A)2×60_6與常規(guī)Poly(A)120相比(圖6),對蛋白產(chǎn)量無負(fù)面影響。
圖6:western blot法測定16HBE14o-裂解物中CFTR蛋白的相對定量。
研究特定Poly(A)間隔長度,構(gòu)建了兩種新的熒光素酶結(jié)構(gòu),分別含有12和24 nt間隔。轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)兩種Poly(A)格式的熒光素酶mRNA表達(dá)降低。修飾特異性效應(yīng)可能由于間隔段區(qū)域影響PABP與Poly(A)結(jié)合。增加間隔長度至6 nt以上,無顯著翻譯或穩(wěn)定性優(yōu)勢。
圖7:A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h熒光素酶表達(dá)及不同多聚(A)熒光素酶mRNA定量測定。
無論是C/T/G中哪種作為間隔子,其翻譯效率接近。
構(gòu)建三種以C、T或G為間隔的Poly(A)序列,并在A549細(xì)胞中比較了它們的luciferase mRNA。結(jié)果顯示,與標(biāo)準(zhǔn)Poly(A)120相比,所有分段Poly(A)構(gòu)建體的熒光素酶表達(dá)均更高(圖8),且除少數(shù)例外,mRNA水平相似(圖9)。單核苷酸間隔的片段Poly(A)可能增強(qiáng)了翻譯效率,并減少了重組率。研究推薦使用帶有6或單核苷酸間隔的分段Poly(A)區(qū)域,因為它對蛋白表達(dá)和mRNA半衰期無負(fù)面影響,同時減少了質(zhì)粒重組。
圖8:A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h熒光素酶表達(dá)及不同多聚(A)熒光素酶mRNA定量測定。
圖9:用單核苷酸間隔物定量分析分段Poly(A)尾重組率。(n)用特定Poly(A)格式測試的熒光素酶克隆總數(shù)。
貨號:BP-11-10
mRNA 的 Poly(A)尾分布檢測是一個復(fù)雜且需要精細(xì)操作的過程。實(shí)驗條件的控制、樣本的處理、酶的選擇和濃度、以及后續(xù)的數(shù)據(jù)分析等步驟都可能影響最終的結(jié)果。因此,在進(jìn)行 Poly(A) 尾分布檢測時,需要嚴(yán)格遵守實(shí)驗步驟,確保樣本的質(zhì)量和純度,以獲得準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。
基于此,寶銳生物首發(fā)推出了針對 mRNA 的 Poly(A)尾分布檢測的 Poly(A)尾分布檢測前處理試劑盒,針對不同特征的 mRNA 序列,不同類型的 Poly(A)尾設(shè)計,均能高效快速的得到 mRNA 的 Poly(A)尾分布情況。
參考文獻(xiàn):
0756-8699969
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