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甲基化敏感內(nèi)切酶在甲基化分析中應(yīng)用

2024-11-14 04:47:38

一、DNA甲基化的概念

表觀遺傳學(xué)是指在基因組的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下,生物個(gè)體表型卻發(fā)生了可遺傳性變化的現(xiàn)象。DNA 甲基化是目前研究最深入的表觀遺傳修飾,簡言之,是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下,以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體,將活性甲基轉(zhuǎn)移至DNA鏈中特定堿基的化學(xué)修飾過程,在哺乳動(dòng)物中,主要生成為5-甲基胞嘧啶(5-mC)。

二、DNA甲基化的調(diào)控作用

在原核生物中,5mC 的主要功能是建立限制性修飾體系,從而識(shí)別和保護(hù)細(xì)菌 DNA 免于外部 DNA 的干擾。在真核生物中,DNA 甲基化的功能則更為復(fù)雜,主要是 DNA 甲基化在真核生物中具有表達(dá)調(diào)控的功能。

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,約 70%的 5mC 修飾發(fā)生在胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(CpG)密集的核酸序列上 即CpG島中,而管家基因的啟動(dòng)子通常在 CpG 島序列內(nèi)。這使得 DNA 甲基化修飾可以阻止轉(zhuǎn)錄因子與 DNA 上的調(diào)控位點(diǎn)相結(jié)合,并通過募集轉(zhuǎn)錄抑制因子來抑制轉(zhuǎn)錄,廣泛的高甲基化修飾可以完全沉默靶基因的表達(dá), 反之低水平的甲基化修飾會(huì)使得基因的轉(zhuǎn)錄激活,靶基因的表達(dá)增加。

在植物中,DNA 甲基化的改變通常會(huì)引起植物形態(tài)的缺陷, 如葉片形狀、根系結(jié)構(gòu)的改變等。

圖1-DNA甲基化修飾對轉(zhuǎn)錄的影響



三、DNA甲基化分析方法的演變

液相色譜法

基本原理是DNA樣品被DNA酶、堿性磷酸酶和核酸外切酶水解,色譜分離后,通過計(jì)算基因組DNA甲基化堿基占比,獲得整體甲基化水平。但無法獲得關(guān)于甲基化發(fā)生的位置信息,目前已經(jīng)不廣泛使用。


二維電泳

限制性內(nèi)切酶切割某些富含CpG位點(diǎn)的基因組區(qū)域,通過二維凝膠電泳分離酶消化后片段。該方法主要應(yīng)用于位點(diǎn)、區(qū)域或器官靶向研究,評估基因組水平的甲基化狀態(tài),該方法分辨率相對較低,因而基于二維電泳的分析技術(shù)正逐漸被取代。


微陣列雜交

微陣列雜交技術(shù)極大促進(jìn)了DNA甲基化組學(xué)分析,其分辨率高于二維電泳技術(shù)。在甲基化測序技術(shù)中,亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化法,甲基化敏感的限制性核酸內(nèi)切酶消化和針對甲基化片段的免疫沉淀3種技術(shù)在DNA樣品的預(yù)處理中采取了不同的方式,但后續(xù)步驟均應(yīng)用微陣列雜交技術(shù)。微陣列技術(shù)的出現(xiàn)促進(jìn)了我們在更廣泛的層面上對 DNA 甲基化模式的理解。盡管增加的樣本量可實(shí)現(xiàn)相對更經(jīng)濟(jì)和全面的 DNA 圖譜,但測序技術(shù)在準(zhǔn)確性和深度上的優(yōu)勢使之逐漸取代芯片平臺(tái)已經(jīng)成為趨勢。


高通量測序技術(shù)

第一代基于測序的甲基化分析適用于在單核苷酸分辨率下分析 DNA 甲基化。在 1990 年代,基于亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的測序(DNA 甲基化分析的“金標(biāo)準(zhǔn)”)的發(fā)展促進(jìn)了基于測序的甲基化分析的突破。二代測序平臺(tái)在基于NGS 技術(shù)的甲基化分析中,由于長 DNA片段的分割,讀取長度縮短,較長的甲基化信息模式丟失,需要大規(guī)模生物信息學(xué)計(jì)算。第三代測序能夠憑借來自其他核苷酸堿基的 5mC 的獨(dú)特信號實(shí)時(shí)檢測長讀長單分子的 DNA 甲基化。因此,長讀長測序促進(jìn)了高通量甲基化組分析的下一次革命。


圖2-DNA甲基化分析方法的演變


四、全基因組DNA甲基化分析的常用方法

1.樣本前處理

通過限制性內(nèi)切酶消化或超聲處理對基因組DNA進(jìn)行片段化。

2.中間步驟

基因組DNA可以進(jìn)行MBD富集、抗體富集、亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化或TET氧化。

MBD富集:利用能夠結(jié)合甲基化DNA的蛋白對甲基化的DNA進(jìn)行免疫沉淀。該技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)基因組中高度甲基化的區(qū)域,不能從單個(gè)堿基水平分析甲基化。

抗體富集:一種采用抗體或甲基化DNA結(jié)合蛋白來捕獲富集甲基化DNA的技術(shù),這種技術(shù)同樣可以發(fā)現(xiàn)基因組中高度甲基化的區(qū)域,如CpG島,但不能進(jìn)行單個(gè)堿基水平的分析。

亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化:通過化學(xué)脫氨的過程將未發(fā)生甲基化的胞嘧啶(C)被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶(U)而甲基化的胞嘧啶則不變。

TET氧化:將甲基化的5mC進(jìn)一步催化成5caC。

3.甲基化檢測

通過微陣列或高通量測序平臺(tái)進(jìn)行分析。

圖3-全基因組DNA甲基化分析的常用方法原理示意圖


五、全基因組DNA甲基化分析常用方法步驟

對全基因組DNA甲基化分析常用方法的主要步驟進(jìn)行整理如下圖,其中在DNA樣品前處理步驟中使用限制性內(nèi)切酶消化的方式是MRE-Seq(甲基化敏感性的限制性內(nèi)切酶測序)和RRBS(亞硫酸鹽測序)。


圖4-DNA甲基化檢測技術(shù)主要步驟


image.png

亞硫酸鹽測序

(RRBS)

步驟


1. 基因組DNA首先被特定的限制性內(nèi)切酶消化,產(chǎn)生片段 (通常在50-300bp的范圍內(nèi)),末端帶有CpG。

2. 由酶消化產(chǎn)生的粘性雙鏈 DNA 3‘ 末端被修復(fù),加A尾 (A-Tailing)。

3加接頭。(加接頭的作用:甲基化序列接頭可以防止亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化過程中胞嘧啶的脫氨)

4.  凝膠電泳,選擇所需的片段大小進(jìn)行純化。

5.  亞硫酸鹽處理選定的 DNA 片段,以將未甲基化的胞嘧啶脫氨到尿嘧啶中。

6.  PCR擴(kuò)增和純化后,DNA產(chǎn)物被適配到測序平臺(tái)上進(jìn)行測序。

方法優(yōu)點(diǎn)


高靈敏度:可以靶向難以用常規(guī)亞硫酸鹽測序,和許多腫瘤類型重復(fù)序列分析的甲基化區(qū)域,非常適合發(fā)育生物學(xué)中的甲基化狀態(tài)分析。

方法缺點(diǎn)


RRBS中使用的限制性內(nèi)切酶不一定能覆蓋所有CpG富集區(qū)域,可能會(huì)遺漏一些位點(diǎn)信息。

圖5-RRBS主要步驟示意圖


甲基化敏感性的限制性內(nèi)切酶測序

(MRE-Seq)

MRE-seq允許等位基因特異性DNA甲基化掃描,并且能夠覆蓋比傳統(tǒng)陣列雜交更廣泛的基因組區(qū)域 。

步驟


1.  MRE-seq通過多種甲基化敏感的限制酶(如 HpaII (CˇCGG)、HinP1I (GˇCGC) 和AciI (CˇCGC) ,等)對基因組進(jìn)行掃描,切割未被甲基化的CpG位點(diǎn)。

2.  合并產(chǎn)物后分選片段,進(jìn)行末端修復(fù)反應(yīng)和單核苷酸接頭連接,PCR擴(kuò)增和純化后上機(jī)測序。

3.  測序結(jié)果與參考基因組比對后,可以將未甲基化的CpG位點(diǎn)可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為甲基化水平。

方法優(yōu)點(diǎn)


MRE-seq是一種單CpG分辨率的DNA甲基化分析方法,適合低CpG密度區(qū)域。

方法缺點(diǎn)


但MRE-seq依賴不同限制酶,基因組中酶切位點(diǎn)的分布限制了其覆蓋范圍,同時(shí)一些不完全酶切可能會(huì)導(dǎo)致一定的假陽性結(jié)果。

圖6-MRE-Seq主要步驟示意圖


HELP-Seq 連接介導(dǎo)PCR富集HpaII微小片段技術(shù)(HELP)


HELP (HpaII tiny fragment Enrichment by Ligation-mediated PCR),采用HpaII及其甲基化不敏感的限制性內(nèi)切酶MspI處理,來對基因組內(nèi)及基因組間的甲基化位點(diǎn)進(jìn)行比較,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)甲基化測序。

步驟


1.   HpaII限制性內(nèi)切酶消化。

2.  寡核苷酸連接,該寡核苷酸對與限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的末端內(nèi)聚物產(chǎn)生末端內(nèi)聚。這可作為 PCR 引物的模板,用于進(jìn)行連接介導(dǎo)的 PCR (LM-PCR)。產(chǎn)物大小為 200 至 2000 bp可以使用各種平臺(tái)分析擴(kuò)增產(chǎn)物。

3.  共雜交到定制的基因組微陣列中。

4.  亞硫酸鹽測序。

方法優(yōu)點(diǎn)


HELP檢測具有穩(wěn)定性、定量性和準(zhǔn)確性。HELP檢測可用于任何基因組微陣列,也可用于檢測對靶序列胞嘧啶甲基化敏感性不同的限制性內(nèi)切酶異裂異構(gòu)體的任何組合。

方法缺點(diǎn)


僅查詢HpaII位點(diǎn),并且在應(yīng)用于陣列時(shí)分辨率相對較低。為了增加評估的CpG數(shù)量,MRE和基于陣列的檢測納入了多個(gè)平行的MRE酶解。

圖7-HELP主要步驟示意圖


寶銳甲基化敏感內(nèi)切酶

產(chǎn)品:HinP1 I, Hha I, Aci I, Hpa II, BssH II, BsrF I, BspE I.

產(chǎn)品特點(diǎn)

特異性:酶切識(shí)別特異性強(qiáng),產(chǎn)物清晰。

高效率:驗(yàn)證酶切效率高。達(dá)到或優(yōu)于進(jìn)口產(chǎn)品。

高保真:過夜酶切,星號活性極低。


推薦產(chǎn)品

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