一、DNA甲基化的概念

表觀遺傳學(xué)是指在基因組的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，生物個(gè)體表型卻發(fā)生了可遺傳性變化的現(xiàn)象。DNA 甲基化是目前研究最深入的表觀遺傳修飾，簡言之，是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將活性甲基轉(zhuǎn)移至DNA鏈中特定堿基的化學(xué)修飾過程，在哺乳動(dòng)物中，主要生成為5-甲基胞嘧啶（5-mC）。

二、DNA甲基化的調(diào)控作用

在原核生物中，5mC 的主要功能是建立限制性修飾體系，從而識(shí)別和保護(hù)細(xì)菌 DNA 免于外部 DNA 的干擾。在真核生物中，DNA 甲基化的功能則更為復(fù)雜，主要是 DNA 甲基化在真核生物中具有表達(dá)調(diào)控的功能。

在植物中，DNA 甲基化的改變通常會(huì)引起植物形態(tài)的缺陷， 如葉片形狀、根系結(jié)構(gòu)的改變等。

圖1-DNA甲基化修飾對轉(zhuǎn)錄的影響

三、DNA甲基化分析方法的演變

基本原理是DNA樣品被DNA酶、堿性磷酸酶和核酸外切酶水解，色譜分離后，通過計(jì)算基因組DNA甲基化堿基占比，獲得整體甲基化水平。但無法獲得關(guān)于甲基化發(fā)生的位置信息，目前已經(jīng)不廣泛使用。

二維電泳

限制性內(nèi)切酶切割某些富含CpG位點(diǎn)的基因組區(qū)域，通過二維凝膠電泳分離酶消化后片段。該方法主要應(yīng)用于位點(diǎn)、區(qū)域或器官靶向研究，評估基因組水平的甲基化狀態(tài)，該方法分辨率相對較低，因而基于二維電泳的分析技術(shù)正逐漸被取代。

微陣列雜交

微陣列雜交技術(shù)極大促進(jìn)了DNA甲基化組學(xué)分析，其分辨率高于二維電泳技術(shù)。在甲基化測序技術(shù)中，亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化法，甲基化敏感的限制性核酸內(nèi)切酶消化和針對甲基化片段的免疫沉淀3種技術(shù)在DNA樣品的預(yù)處理中采取了不同的方式，但后續(xù)步驟均應(yīng)用微陣列雜交技術(shù)。微陣列技術(shù)的出現(xiàn)促進(jìn)了我們在更廣泛的層面上對 DNA 甲基化模式的理解。盡管增加的樣本量可實(shí)現(xiàn)相對更經(jīng)濟(jì)和全面的 DNA 圖譜，但測序技術(shù)在準(zhǔn)確性和深度上的優(yōu)勢使之逐漸取代芯片平臺(tái)已經(jīng)成為趨勢。

高通量測序技術(shù)

第一代基于測序的甲基化分析適用于在單核苷酸分辨率下分析 DNA 甲基化。在 1990 年代，基于亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的測序（DNA 甲基化分析的“金標(biāo)準(zhǔn)”）的發(fā)展促進(jìn)了基于測序的甲基化分析的突破。二代測序平臺(tái)在基于NGS 技術(shù)的甲基化分析中，由于長 DNA片段的分割，讀取長度縮短，較長的甲基化信息模式丟失，需要大規(guī)模生物信息學(xué)計(jì)算。第三代測序能夠憑借來自其他核苷酸堿基的 5mC 的獨(dú)特信號實(shí)時(shí)檢測長讀長單分子的 DNA 甲基化。因此，長讀長測序促進(jìn)了高通量甲基化組分析的下一次革命。

圖2-DNA甲基化分析方法的演變

四、全基因組DNA甲基化分析的常用方法

1．樣本前處理

通過限制性內(nèi)切酶消化或超聲處理對基因組DNA進(jìn)行片段化。

2．中間步驟

基因組DNA可以進(jìn)行MBD富集、抗體富集、亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化或TET氧化。

MBD富集：利用能夠結(jié)合甲基化DNA的蛋白對甲基化的DNA進(jìn)行免疫沉淀。該技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)基因組中高度甲基化的區(qū)域，不能從單個(gè)堿基水平分析甲基化。

抗體富集：一種采用抗體或甲基化DNA結(jié)合蛋白來捕獲富集甲基化DNA的技術(shù)，這種技術(shù)同樣可以發(fā)現(xiàn)基因組中高度甲基化的區(qū)域，如CpG島，但不能進(jìn)行單個(gè)堿基水平的分析。

亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化：通過化學(xué)脫氨的過程將未發(fā)生甲基化的胞嘧啶（C）被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U）而甲基化的胞嘧啶則不變。

TET氧化：將甲基化的5mC進(jìn)一步催化成5caC。

3．甲基化檢測

通過微陣列或高通量測序平臺(tái)進(jìn)行分析。

圖3-全基因組DNA甲基化分析的常用方法原理示意圖

五、全基因組DNA甲基化分析常用方法步驟

對全基因組DNA甲基化分析常用方法的主要步驟進(jìn)行整理如下圖，其中在DNA樣品前處理步驟中使用限制性內(nèi)切酶消化的方式是MRE-Seq（甲基化敏感性的限制性內(nèi)切酶測序）和RRBS（亞硫酸鹽測序）。

圖4-DNA甲基化檢測技術(shù)主要步驟

1. 基因組DNA首先被特定的限制性內(nèi)切酶消化，產(chǎn)生片段 (通常在50-300bp的范圍內(nèi))，末端帶有CpG。

2. 由酶消化產(chǎn)生的粘性雙鏈 DNA 3‘ 末端被修復(fù)，加A尾 (A-Tailing)。

3. 加接頭。(加接頭的作用：甲基化序列接頭可以防止亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化過程中胞嘧啶的脫氨)

4.  凝膠電泳，選擇所需的片段大小進(jìn)行純化。

5.  亞硫酸鹽處理選定的 DNA 片段，以將未甲基化的胞嘧啶脫氨到尿嘧啶中。

6.  PCR擴(kuò)增和純化后，DNA產(chǎn)物被適配到測序平臺(tái)上進(jìn)行測序。

高靈敏度：可以靶向難以用常規(guī)亞硫酸鹽測序，和許多腫瘤類型重復(fù)序列分析的甲基化區(qū)域，非常適合發(fā)育生物學(xué)中的甲基化狀態(tài)分析。

RRBS中使用的限制性內(nèi)切酶不一定能覆蓋所有CpG富集區(qū)域，可能會(huì)遺漏一些位點(diǎn)信息。

圖5-RRBS主要步驟示意圖

MRE-seq允許等位基因特異性DNA甲基化掃描，并且能夠覆蓋比傳統(tǒng)陣列雜交更廣泛的基因組區(qū)域 。

1.  MRE-seq通過多種甲基化敏感的限制酶（如 HpaII (CˇCGG)、HinP1I (GˇCGC) 和AciI (CˇCGC) ，等）對基因組進(jìn)行掃描，切割未被甲基化的CpG位點(diǎn)。

2.  合并產(chǎn)物后分選片段，進(jìn)行末端修復(fù)反應(yīng)和單核苷酸接頭連接，PCR擴(kuò)增和純化后上機(jī)測序。

3.  測序結(jié)果與參考基因組比對后，可以將未甲基化的CpG位點(diǎn)可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為甲基化水平。

MRE-seq是一種單CpG分辨率的DNA甲基化分析方法，適合低CpG密度區(qū)域。

但MRE-seq依賴不同限制酶，基因組中酶切位點(diǎn)的分布限制了其覆蓋范圍，同時(shí)一些不完全酶切可能會(huì)導(dǎo)致一定的假陽性結(jié)果。

圖6-MRE-Seq主要步驟示意圖

HELP (HpaII tiny fragment Enrichment by Ligation-mediated PCR),采用HpaII及其甲基化不敏感的限制性內(nèi)切酶MspI處理，來對基因組內(nèi)及基因組間的甲基化位點(diǎn)進(jìn)行比較，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)甲基化測序。

1.   HpaII限制性內(nèi)切酶消化。

2.  寡核苷酸連接，該寡核苷酸對與限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的末端內(nèi)聚物產(chǎn)生末端內(nèi)聚。這可作為 PCR 引物的模板，用于進(jìn)行連接介導(dǎo)的 PCR （LM-PCR）。產(chǎn)物大小為 200 至 2000 bp可以使用各種平臺(tái)分析擴(kuò)增產(chǎn)物。

3.  共雜交到定制的基因組微陣列中。

4.  亞硫酸鹽測序。

HELP檢測具有穩(wěn)定性、定量性和準(zhǔn)確性。HELP檢測可用于任何基因組微陣列，也可用于檢測對靶序列胞嘧啶甲基化敏感性不同的限制性內(nèi)切酶異裂異構(gòu)體的任何組合。

僅查詢HpaII位點(diǎn)，并且在應(yīng)用于陣列時(shí)分辨率相對較低。為了增加評估的CpG數(shù)量，MRE和基于陣列的檢測納入了多個(gè)平行的MRE酶解。

圖7-HELP主要步驟示意圖

寶銳甲基化敏感內(nèi)切酶

產(chǎn)品：HinP1 I, Hha I, Aci I, Hpa II, BssH II, BsrF I, BspE I.

產(chǎn)品特點(diǎn)

特異性：酶切識(shí)別特異性強(qiáng)，產(chǎn)物清晰。

高效率：驗(yàn)證酶切效率高。達(dá)到或優(yōu)于進(jìn)口產(chǎn)品。

高保真：過夜酶切，星號活性極低。

推薦產(chǎn)品

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