文章來源：分子莊園

作者：木子莊主 

聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質的一種常用電泳技術，可用于蛋白質和核酸的分離。

一、聚丙烯酰胺凝膠

聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺（Acr）和N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）在引發(fā)劑（eg.APS）和加速劑（eg.TEMED）的作用下聚合而成。

1. 聚合原理

在聚合過程中，四甲基乙二胺（TEMED）的游離羥基促進過硫酸銨[(NH?)?S?O?]的水溶液產生SO42?自由基，自由基使單體丙烯酰胺和N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺的C-C雙鍵打開而被活化，活化的自由基丙烯酰胺之間能發(fā)生聚合形成丙烯酰胺長鏈，同時活化的甲叉雙丙烯酰胺在不斷延長的丙烯酰胺鏈間形成甲叉鍵交聯，從而形成交聯的三維網狀結構。

丙烯酰胺還有一種光聚合法，催化劑是核黃素，核黃素在光照下能夠產生自由基，催化聚合反應。

2. 濃度控制

聚合后的聚丙烯酰胺凝膠的強度、彈性、透明度、粘度和孔徑大小均取決于膠的濃度和交聯度。

聚丙烯酰胺凝膠的孔徑可以通過改變丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的濃度來控制，丙烯酰胺的濃度可以在3%-30%之間。低濃度的凝膠具有較大的孔徑，如3%的聚丙烯酰胺凝膠對蛋白質沒有明顯的阻礙作用，可用于平板等電聚焦或SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮膠，也可以用于分離DNA；高濃度凝膠具有較小的孔徑，對蛋白質有分子篩的作用，可以用于根據蛋白質的分子量進行分離的電泳中，如10%-20%的凝膠常用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離膠。

3. 優(yōu)點

聚丙烯酰胺凝膠因有許多突出的優(yōu)點而得到廣泛的應用。其主要的優(yōu)點有：

1）可以隨意控制膠濃度和交聯度，從而得到不同的有效孔徑，用于分離不同分子量的生物大分子。

2）能把分子篩作用和電荷效應結合在同一方法中，達到更高的靈敏度，且聚丙烯酰胺凝膠是由-C-C-鍵結合的酰胺多聚物，側鏈只有不活潑的酰胺基-CO-NH2，沒有帶電的其他離子基團，化學惰性好，電泳時不會產生“電滲”。

3）因為可以制得高純度的單體原料，電泳分離的重復性好；且凝膠機械強度好，有彈性，不易碎，便于操作和保存，還可以用作固定化酶的惰性載體。

4）凝膠透明度高，便于照相和復印，且無紫外吸收，不染色就可以用于紫外波長的凝膠掃描作定量分析。

二、聚丙烯酰胺凝膠電泳分類

1. 連續(xù)與不連續(xù)電泳體系

PAGE根據其有無濃縮效應分為連續(xù)體系和不連續(xù)體系兩大類。

1）連續(xù)體系指在整個電泳體系中的緩沖液pH值和凝膠孔徑大?。舛龋┫嗤?，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應，主要用于分析核酸樣本。

2）不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成：①濃縮膠是4%丙烯酰胺濃度的大孔膠，制膠緩沖液為pH6.8的Tris-HCl；②分離膠是12.5%丙烯酰胺濃度的小孔膠，制膠緩沖液為pH8.8的Tris-HCl；③電極緩沖液是pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液。

2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應，分子篩效應，還具有濃縮效應，因而其分離條帶清晰度及分辨率均比連續(xù)體系要好，主要用于蛋白質樣品的分離。

2、變性和非變性電泳體系

PAGE有非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE）和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳兩種形式。

1）非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE）

Native-PAGE可以使生物大分子在電泳過程中保持其天然的形狀和電荷，它們的分離是依據其電泳遷移率的不同和凝膠的分子篩作用，尤其是在電泳分離后仍能保持蛋白質和酶等生物大分子的生物活性，對于生物大分子的鑒定有重要意義。

在蛋白質的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，依據的是蛋白質的分子量大小、蛋白質的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開；在DNA的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，DNA呈雙鏈狀態(tài)泳動，其遷移率會受堿基組成和序列的影響。

2）變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

在變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，加入了變性劑，生物大分子的分離僅依據于分子量大小，蛋白質變性劑常為SDS，核酸變性劑常為尿素、甲酰胺等。

三、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

SDS-PAGE是最常用的一種蛋白表達分析技術，此項技術的原理是根據樣本中蛋白質分子量大小的不同，使其在電泳膠中分離。其通常用于檢測蛋白的表達情況以及分析目的蛋白的純度等。

1、SDS-PAGE的實驗過程

1）樣本處理

蛋白中含有很多的氨基(+)和羧基(-)，不同的蛋白在不同的pH值下表現出不同的電荷，為了使蛋白在電泳中的遷移率只與分子量有關，在上樣前通常會進行一些處理。即在樣品中加入含有SDS和β-巰基乙醇／DTT的上緩沖液。

根據樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。

①還原SDS處理

在上樣buffer中加入SDS和DTT/β-巰基乙醇后，蛋白質構象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結合的分子，在電泳中，只根據分子量來分離。

上樣buffer中通常還加入溴酚藍染料，用于監(jiān)控電泳進程，另外也可加有適量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加樣時樣品溶液可以沉入樣品凹槽底部。

一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。

②帶有烷基化作用的還原SDS處理

碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經久牢固的保護SH基團，使完全變性的蛋白質保持還原狀態(tài)；另碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止銀染時的紋理現象。100μL樣品緩沖液中10μL20%的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。

③非還原SDS處理

生理體液、血清、尿液等樣品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，不加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不作為測定分子量來使用。

SDS（十二烷基硫酸鈉）是一種陰離子去污劑，它可以斷開分子內和分子間的氫鍵，破壞蛋白質分子的二級和三級結構；強還原劑β-巰基乙醇／二硫蘇糖醇可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵。

在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，蛋白質分子被完全變性，解聚成多肽鏈，SDS和多肽鏈上的氨基酸側鏈結合成蛋白-SDS膠束（平均每兩個氨基酸殘基結合一個SDS分子），并附帶上大量的負電荷，所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異。

SDS與蛋白質結合后，還可引起構象改變，蛋白質-SDS復合物形成近似“雪茄煙”形的長橢圓棒，不同蛋白質的SDS復合物的短軸長度都一樣，約為18?（1?=0.1nm），這樣的蛋白質-SDS復合物，在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質原的電荷和形狀的影響，而只取決于分子量的大小。

2）凝膠配置

制備凝膠時首先要根據待分離樣品的情況選擇適當的分離膠濃度，如果要分離較大的蛋白質，需要使用低濃度如10%或7.5%的凝膠（孔徑較大）；而對于分離較小的蛋白質，使用的較高濃度凝膠（孔徑較?。┛梢缘玫礁玫姆蛛x效果。

分離膠聚合后，通常在上面加上一層濃縮膠（約1 cm），并在濃縮上插入樣品梳，形成上樣凹槽。

溴酚藍指示劑是一個較小的分子，可以自由通過凝膠孔徑，所以它顯示著電泳的前沿位置。

當指示劑到達凝膠底部時，停止電泳，從平板中取出凝膠。在適當的染色液中(如通常使用的考馬斯亮藍)染色幾個小時，而后過夜脫色。脫色液去除凝膠中未與蛋白結合的背底染料，這時就可以清晰地觀察到凝膠中被染色的蛋白質區(qū)帶。

2、高pH堿性不連續(xù)系統特點

1）濃縮膠的pH(6.8)小于慢離子甘氨酸的pKa(9.8)3個pH左右，所以α≈0.001，即在濃縮膠中甘氨酸只有0.1%離解，因此在電場中遷移很慢，是慢離子。

2）快離子Cl?由于幾乎全部離解，電泳遷移率最大，不受pH變化的影響。

3）分離膠的pH(8.8)小于慢離子的pKa一個pH左右，α≈0.1，所以在分離膠中甘氨酸離解加大，電泳遷移率加大，就趕到蛋白質帶的前面。

4）電極緩沖液中共軛堿Tris的pKa小于分離膠的pH(8.8)約1個pH，使其緩沖能力增大；電極緩沖液的pH為8.3，相近于Tris的pKa(8.1)，以便獲得最大的緩沖能力。

3、SDS-PAGE的應用

1）未知蛋白分子量的測定

當分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質的遷移率和分子量的對數呈線性關系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數，若將已知分子量的標準蛋白質的遷移率對分子量的對數作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質在相同條件下進行電泳，根據它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。

2）蛋白提純過程中純度的檢測

純化的蛋白質通常在SDS電泳上應只有一條帶，但如果蛋白質是由不同的亞基組成的，它在電泳中可能會形成分別對應于各個亞基的幾條帶。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高的靈敏度，一般只需要不到微克量級的蛋白質，而且通過電泳還可以同時得到關于分子量的情況，這些信息對于了解未知蛋白及設計提純過程都是非常重要的。

4、SDS-PAGE電泳常見問題

1）關于凝膠的制備

通常凝膠在30min-1h內凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，AP劑量不夠。 如果凝的太快，可能是AP和TEMED用量過多。待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時間使用，忌即配即用或冰箱放置，前者易導致凝固不充分，后者可導致SDS結晶。

高濃度膠在溫度較低（冬天）的情況下，凝膠不均勻，在分離膠的下部易出現波浪樣的花紋；此時可以加大TEMED和過硫酸胺的量，使其凝結速度加快。高濃度凝膠脆性強易碎，在室溫較高的情況下可以適當減少TEMED和過硫酸胺的量。

2）條帶異常情況

①出現“微笑”形帶（兩邊翹起中間凹下︶）：在較厚的凝膠中，由于凝膠不均勻冷卻，中間部分凝固不好所致。

②出現“皺眉”形帶（兩邊向下中間鼓起︵）：一般原因是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈，可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。

③帶出現拖尾：樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起，此外可能是灌膠時分離膠過多導致濃縮膠很少，不能起到濃縮作用，沒有把樣品壓成一條線。建議選擇適當的樣品緩沖液，加適量樣品促溶劑；若電泳緩沖液時間過長，重新配制；降低凝膠濃度。

④帶出現紋理現象：主要是樣品不溶性顆粒引起的。建議加適量樣品促溶劑。

⑤電泳的條帶過粗：蛋白質樣品未濃縮好，適當增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的pH正確（6.8）；適當降低電壓。

⑥“鬼帶”的出現及處理：“鬼帶”就是在跑構象復雜的蛋白質大分子時，在泳道頂端出現一些未知條帶或在加樣孔底部生成沉淀，這主要是因為還原劑在加熱的過程中被氧化失活，使解離的蛋白質分子重新折疊和亞基重新締合，由于其分子量通常要比目標條帶大，所以會生成未知條帶或沉淀。建議在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或β-巰基乙醇，以補充不足的還原劑，或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。

⑦目的蛋白質條帶模糊：電泳凝膠濃度選擇不當（低于10Kd的小分子蛋白質要用Tricine膠）；蛋白質樣品水解，注意除去蛋白質樣品的內源性的水解酶，不要反復凍融，緩沖溶液、SDS都要新鮮配制；避免加樣過多，提高分辨率，加樣體積根據樣品濃度和凝膠厚度靈活掌握，一般上樣體積為10-15uL（即2-10ug蛋白質）。

加熱變性后的蛋白質樣品要放置到室溫即電泳，不要久放，更不要扔到冰箱里保存，因為蛋白質的二硫鍵在高溫下可能是會斷開，但是暴露于空氣中溫度降低會重新形成二硫鍵，而且可能在過久放置過程中蛋白質可能會再折疊。

3）電泳異常情況

①電泳電壓很高但電流很低（電壓50v以上，可電流卻在5mA以下）：主要原因是電泳槽沒有正確裝配，電流未形成通路。包括內外槽裝反，外槽液過少等。

②電泳時間比正常要長：可能是因為凝膠緩沖系統和電級緩沖系統地PH選擇錯誤，即緩沖系統的PH和被分離物質的等電點差別太小，或緩沖系統的離子強度太高。

③溴酚藍不能起到指示作用：在實驗中有時會出現溴酚藍已跑出板底，但蛋白質卻還未跑下來的現象。主要原因可能是緩沖液和分離膠的濃度過高，建議更換正確pH值的緩沖液，降低分離膠的濃度。

④電泳完后膠上有很多長條紋的雜帶：建議電泳緩沖液不要回收利用，配制膠的溶液一定要純。

配膠緩沖液系統在電泳中的影響：

緩沖液在電泳過程中的主要作用是維持合適的pH。電泳時正極與負極都會發(fā)生電解反應，正極發(fā)生的是氧化反應，負極發(fā)生的是還原反應，長時間的電泳將使正極變酸，負極變堿，緩沖液可以維持溶液兩極的pH保持基本不變。在濃縮膠中，pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，泳動效率低；而Cl?卻很高，兩者之間形成導電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動并聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。所以，pH對整個反應體系的影響是至關重要的，實驗中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應首要考慮該因素。

四、PAGE與DNA分析

1、試劑配置

①30% Acr-Bis（29：1）：29g丙烯酰胺，1gN,N′-亞甲基雙丙烯酰胺，加蒸餾水至100mL。

配成30%的丙烯酰胺水溶液在4℃下能保存1個月，在貯存期間丙烯酰胺會水解為丙烯酸而增加電泳時的電內滲現象并減慢電泳的遷移率。丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是一種對中樞神經系統有毒的試劑，操作時要避免直接接觸皮膚，但它們聚合后則無毒。

②10%過硫酸銨(Aps)：0.4g過硫酸銨，4mL蒸餾水。

③1×TBE 緩沖液：89mol/LTris-硼酸鹽，2mol/L EDTA(pH8.0)。

④加樣緩沖液：0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青FF，40%蔗糖水溶液(W/V) 4℃貯存。

2、凝膠配制

3、有效DNA分離范圍

4、VS瓊脂糖凝膠

和瓊脂糖凝膠相比，聚丙烯酰胺凝膠難于制備和處理，分離范圍較窄。但是它們也有突出的優(yōu)點，由于是不連續(xù)的pH梯度，故樣品被壓縮成一條狹窄的區(qū)帶，因而增強了分離效果，提高電泳分辨率，尤其對小DNA片段的分析(5～500bp)，在這一范圍內，僅差1bp的DNA分子也能清晰地分開。

其次，回收的DNA純度很高，如可直接用于小鼠胚胎顯微注射。在引物的純化中也常用此凝膠進行純化，也稱PAGE純化。

5、DNA染色

與瓊脂糖凝膠不同，聚丙烯酰胺凝膠灌膠時不能加入核酸染料，因為染料會影響丙烯酰胺的聚合、還會妨礙DAN的遷移并使DNA條帶變形；所以一般是電泳后采用泡染法染色。

6、DNA回收

PAGE和瓊脂糖成膠原理不同：聚丙烯酰胺凝膠的凝結是化學過程，其中的丙烯酰胺單體通過化學反應聚合成高聚物，化學反應的特點就是溫度越高，反應速度越快。而瓊脂糖凝膠凝結是物理過程，其中的瓊脂糖長鏈在整個過程中沒有變化，有所變化的是氫鍵等次級鍵的結合情況。溫度越低，氫鍵結合越牢固。

所以一般通過壓碎和浸泡法從聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA，因為一般回收溫度下凝膠不會被融化，只有通過DNA的自發(fā)運動從凝膠回到溶液中。

7、電泳注意事項

1）一般使用0.5X/1X TBE、1~8V/cm低電壓電泳，若在較高電壓下進行，凝膠中部產熱不均勻，造成DNA條帶彎曲，甚至導致小片段DNA解鏈。

2）間隔玻璃板厚度可為0.5~2mm,凝膠越厚，電泳時產熱越多；過多熱量可導致DNA條帶的“微笑”現象。

3）緩沖液槽和凝膠中務必使用同一批次的電泳緩沖液；離子強度或PH的微小差異會造成緩沖液功能紊亂，從而使DNA片段的遷移嚴重失真。為防止電泳后區(qū)帶拖尾，樣品中鹽離子強度應盡量降低。