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酶聯(lián)免疫法精準(zhǔn)檢測E.coli宿主細(xì)胞蛋白

2024-09-06 10:28:42

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在生物制藥領(lǐng)域，利用培養(yǎng)的宿主細(xì)胞（如細(xì)菌、酵母、哺乳動物、昆蟲或植物細(xì)胞）生產(chǎn)重組蛋白、抗體、疫苗等生物藥物的過程中，由于細(xì)胞分泌、應(yīng)激、裂解及純化工藝而產(chǎn)生的雜質(zhì)蛋白被稱為宿主蛋白。藥物中殘留的宿主蛋白可能具有免疫原性、影響藥物質(zhì)量、安全性和有效性，因此在研發(fā)下游純化的工藝時，必須具有一種科學(xué)合理的測定成品或者半成品中宿主蛋白濃度的方法。

酶聯(lián)免疫法（ELISA）作為一種靈敏度高、操作簡便的技術(shù)手段，已被廣泛應(yīng)用于E.coli宿主細(xì)胞蛋白殘留的檢測。

酶聯(lián)免疫法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，簡稱ELISA) 是一種基于抗原-抗體特異性反應(yīng)的免疫學(xué)檢測技術(shù)，包含雙抗體夾心法、間接法、競爭法等。該方法通過將酶與特異性抗體或抗原相結(jié)合，實現(xiàn)對目標(biāo)分子的高靈敏度檢測。

在生物制藥領(lǐng)域，ELISA常用于檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液、發(fā)酵液或純化樣品中的宿主細(xì)胞蛋白，以確保藥物產(chǎn)品的安全性和純度。

酶聯(lián)免疫檢測原理

免疫原性

宿主細(xì)胞蛋白具有多種生理化學(xué)和免疫學(xué)特性的復(fù)雜混合物，可能會觸發(fā)Toll-Like受體介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)，或者直接由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子刺激機(jī)體，產(chǎn)生組胺，發(fā)生炎癥反應(yīng)。因此幾乎所有HCP都有作為外來蛋白藥物的臨床安全風(fēng)險。

類免疫佐劑作用

可以作為佐劑增加機(jī)體對治療蛋白的免疫反應(yīng)，及產(chǎn)生抗體“ADA”，從而直接影響藥物在生物分布，藥代動力學(xué)和生物活性。

影響產(chǎn)品穩(wěn)定性

宿主細(xì)胞蛋白潛在的蛋白酶或“輔料酶”活性，可能導(dǎo)致產(chǎn)品穩(wěn)定性下降，藥效變化。并且其生物活性，可能導(dǎo)致藥效變化。

美國藥典

HCP殘留量<0.01％（即1mg總蛋白中HCP含量應(yīng)小于100ng，即100ppm)。
在上市申請前，應(yīng)至少對3批注冊批（如工藝驗證批）進(jìn)行定量檢測，以證明純化工藝的清除效果。
純化工藝發(fā)生變更時，需重新開展清除驗證研究。
美國藥典（USP) 《mRNA藥物的表征與放行測試》中推薦T7 RNA聚合酶、dsRNA等IVT體系殘留的檢測方法為ELISA。

中國藥典

針對CHO細(xì)胞和酵母菌，HCP殘留<0.05％，即500ppm，針對E.coIi，HCP殘留需要<0.01％，即100ppm。
工藝相關(guān)雜質(zhì)的質(zhì)量控制通常在原液階段進(jìn)行。
如經(jīng)充分驗證證明生產(chǎn)工藝對工藝相關(guān)雜質(zhì)的去除已達(dá)到高水平時，工藝相關(guān)雜質(zhì)的質(zhì)量控制可不列入常規(guī)放行檢測。

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酶聯(lián)免疫法作為一種成熟、可靠的檢測技術(shù)，在E.coli宿主細(xì)胞蛋白檢測中發(fā)揮著重要作用。通過合理設(shè)計實驗步驟和選擇特異性抗體，該方法有助于提高生物制藥產(chǎn)品的質(zhì)量，保障患者用藥安全。未來，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，酶聯(lián)免疫法有望在更多領(lǐng)域發(fā)揮其優(yōu)勢，為人類健康事業(yè)貢獻(xiàn)力量。